Синхронный тест смеси фармацевтических субстанций с помощью лабораторных устройств ВЭЖХ с диодно-матричным детектором

ВВЕДЕНИЕ

Как рецептурные, так и безрецептурные препараты содержат как минимум один активный фармацевтический ингредиент (АФИ) – биологически активное вещество с определенной терапевтической эффективностью. Часто для лечения симптомов используется комбинация нескольких АФИ. Необходимость в точных качественных и количественных методах анализа комбинированных фармацевтических препаратов постоянно растет.

При производстве фармацевтических препаратов содержание активных ингредиентов должно строго контролироваться. Также крайне важно вести наблюдения за пациентами, принимающими комбинированные препараты в течение длительного времени, для оценки риска передозировки и/или долгосрочных побочных эффектов, связанных с хроническим воздействием АФИ.
Компания SCION Instruments предлагает использовать метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектором (HPLC-DAD) для одновременного определения двух распространенных безрецептурных препаратов; Ибупрофен и Парацетамол, часто использующихся в комбинации как жаропонижающие, анальгетические и противовоспалительные средства. При использовании детектора с диодной матрицей можно идентифицировать несколько АФИ за один анализ за счет возможности установки длин волн для каждого анализируемого соединения, а также использования спектров поглощения для дальнейшего подтверждения фармацевтических ингредиентов. Возможность выбора нескольких конкретных длин волн обеспечивает максимальное поглощение веществ на заданной длине волны, улучшая идентификацию.

ЭКСПЕРИМЕНТ

 Для реализации данной методики использовался жидкостной хроматограф SCION LC 6000 с диодно-матричным детектором (DAD).
Программное обеспечение CompassCDS использовалось контроля аналитического процесса, включая сбор данных, их интерпретацию и отчет о результатах.
Калибровочные стандарты, содержащие как ибупрофен, так и парацетамол, были приготовлены в следующих концентрациях: 10, 50, 100, 200 и 400 мг/л в метаноле. Одну таблетку каждого препарата растворяли в 100 мл подвижной фазы (буфер из фосфорной кислоты / метанол в соотношении 30:70), обрабатывали в ультразвуковой бане и добавляли еще 100 мл подвижной фазы. Далее образцы центрифугировали в течение 10 минут при скорости 3000 оборотов в минуту, а затем фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.

Приготовленные образцы переносили в виалы автоподатчика SCION LC 6000.
В случае проведения определения парацетамола и ибупрофена в образцах крови нужно предварительную экстракцию растворителем. Условия для проведения анализа на хроматографе SCION LC 6000 можно увидеть в таблице 1.

Условия проведения анализа
Колонка	С18 250 мм х 4,6 мм, 5 мкм
Температура	25 °С
Элюент	А: фосфатный буфер B: метанол
Градиент	0-6 мин: B – 70% 6.1-15 мин: В – 90%
Скорость потока	1 мл/мин
Параметры детектора	220-400 нм Ибупрофен: 237 нм Парацетамол: 254 нм

Таблица 1. Аналитические условия HPLC-DAD

РЕЗУЛЬТАТ

Линейность ВЭЖХ системы тестировали с помощью приготовленных аналитических стандартов ибупрофена и парацетамола в диапазоне 10-400 мг/л. Оптимальные длины волн для ибупрофена и парацетамола задавались на детекторе с диодной матрицей. На рис. 1а показана калибровочная кривая ибупрофена при длине волны 237 нм, на рис. 1b показана калибровочная кривая парацетамола при длине волны 254 нм.

Рисунок 1а: калибровочная кривая ибупрофена при длине волны 237 нм


Рисунок 1b: калибровочная парацетамола при длине волны 254 нм

ВЭЖХ SCION продемонстрировала превосходную линейность в диапазоне концентраций 10–400 мг/л для обоих целевых соединений, каждое со значением R² 0,9994. В соответствии со стандартами калибровки был проанализирован образец, содержащий экстракты таблеток ибупрофена и парацетамола. На рис. 2 показаны сложенные хроматограммы обоих целевых соединений при их конкретных длинах волн.

Ибупрофен имеет максимальное поглощение при длине волны 237 нм, а парацетамол – при 254 нм. Использование многоволновой способности детектора с диодной матрицей позволило обнаружить оба целевых соединения за одну инъекцию менее чем за 12 минут. Концентрацию обоих целевых соединений определяли по соответствующим калибровочным кривым. Количественные значения концентрации ибупрофена составили 34,11 мг/л, а парацетамола – 39,24 мг/л.

Для дальнейшей идентификации и уверенности в результатах спектры поглощения целевых соединений также сравнивали со спектральной библиотекой. На рисунке 3а показано сравнение спектров поглощения образца ибупрофена со спектрами стандарта ибупрофена, а рисунке 3b показано сравнение спектров поглощения образца парацетамола и стандарта парацетамола.

Рисунок 2: Суммарная хроматограмма целевых соединений

Рисунок 3а. Сравнение спектров поглощения Ибупрофена

Рисунок 3b. Сравнение спектров поглощения Парацетамола

Программное обеспечение CompassCDS использовалось для сравнения полученных спектров с данными библиотек, в данному случае использовалась собственная справочная библиотека. На рис. 3a/b показано наложение спектров поглощения, полученных при анализе образца и при анализе эталонного стандарта, в котором ибупрофен и парацетамол продемонстрировали 100% совпадение, что подтверждает положительную идентификацию обоих целевых соединений (спектры образца наложены на спектр эталона, совпадение составляет 100%, эталонные спектры не видны). Для гарантии точных и сходимых результатов были выполнены шесть последовательных вводов калибровочного стандарта 10 мг/л. На рис. 4 показаны наложенные хроматограммы для ибупрофена и для парацетамола.

Рисунок 4. Наложение хроматограмм для стандартных образцов 10 мг/л

Наблюдалась превосходная воспроизводимость для стандартного образца с концентрацией 10 мг/л в течение шести последовательных инъекций; с RSD 0,27% для ибупрофена при 237 нм и 0,18% для парацетамола при 254 нм. Время удерживания также было стабильным и воспроизводимым со значениями RSD 0,06% и 0,04% соответственно. Наблюдаемая превосходная воспроизводимость и линейность демонстрируют надежность системы ВЭЖХ SCION LC6000.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Компания SCION Instruments разработала быстрый и точный метод одновременной идентификации и количественного определения комбинированных препаратов с помощью ВЭЖХ-DAD. Этот метод имеет решающее значение для многих отраслей промышленности, включая фармацевтику и токсикологию. С помощью одной инъекции при использовании многоволновых возможностей диодного матричного детектора стало возможным четко разделить ибупрофен и парацетамол, два широко используемых безрецептурных препарата менее чем за 12 минут. Идентификация соединения дополнительно подтверждалась сравнением спектров поглощения с использованием CompassCDS. Превосходная линейность и повторяемость SCION HPLC-DAD были продемонстрированы низкими значениями RSD и высокими значениями R².